Test immunoenzymatyczny (ELISA ELISA). Istotą zasady metody i etapy badań. Analiza klas przeciwciał przeciwciał kompleksu immunologicznego.

W związku z rozwojem technologii komórkowej, biologii molekularnej, genetyki, fizyki, chemii i wielu innych dziedzinach high-tech w codziennej praktyce wprowadzenie nowych metod precyzyjnych i high-tech. Tendencje te wpływają i interdyscyplinarna dziedzina wiedzy medycznej i pokrewnych dziedzin biologicznych, biochemicznych problemów. szeroko rozpowszechnione i wprowadzenie powszechnego metody klinicznej diagnostyki laboratoryjnej, zwany enzym immunologiczny w ciągu ostatnich dziesięciu lat.

Ogólnie technologia reakcjach immunologicznych i enzymatycznych radiologiczne szeroko stosowane w typowania komórek, hodowli komórkowych różnych tkanek od początku lat 80. XX wieku. Jednak metody te są bardzo czasochłonne, a nie jednolita, nie znormalizowane, co wyklucza ich zastosowanie w celach leczniczych i diagnostycznych w stada. Metody te wykorzystują wąski, high-tech i wysoce wyspecjalizowanego laboratorium.

Jednak wraz z rozwojem technologii, mikrotechnik, produkcja różnych materiałów biopolimerów dokonane możliwe wytwarzanie gotowych zestawów ELISA diagnostyki, które będą w stanie korzystać z laboratorium medycznego instytucji przedmiotów zintegrowanych. Test ELISA jest szeroko stosowany do diagnozy różnych zakażeń (Chlamydia, kiły, wirus cytomegalii, toksoplazmoza, opryszczka, itd), zarówno ostrych jak i przewlekłych i utajonych form występujących bez klinicznych simptomov.Takzhe ta metoda jest stosowana do ograniczania chronicznych choroby. Spróbujmy zrozumieć, czym jest ta metoda i jakie zasady jest ona oparta?

Składniki testem immunosorbcyjnym - odpowiedź immunologiczną i reakcją enzymatyczną

Enzyme Immunoassay, jak sama nazwa wskazuje, składa się z dwóch składników - reakcje odpornościowe i reakcji enzymatycznych. Odpowiedź immunologiczna wywołuje wiążące cząsteczki biologiczne, komórki lub komórek mikroorganizmów, które są rzeczywiście starają się znaleźć, a reakcja enzymatyczna pozwala nam zobaczyć i zmierzyć wyniku reakcji immunologicznej. Oznacza to, że odpowiedź immunologiczna - jest częścią złożonej techniki, które rzeczywiście wykrywa pożądany mikroba. Enzymatycznej reakcji - jest tą częścią złożonego techniki, który umożliwia przełożenie rezultat reakcji immunologicznej w postaci oczu widoczne i dostępne do pomiaru rutynowych technik chemicznych. Na podstawie takiego sposobu struktura immunologicznych, analizujemy obu stron osobno.

Odpowiedź immunologiczna to jest? Co to przeciwciało, antygen?

Jaka jest odpowiedź immunologiczna? Co to jest antygen?
Najpierw przeanalizować co immunologicznego reakcje. Odpowiedzi immunologiczne - specyficzną reakcję wiązania antygenu z przeciwciałem, tworząc kompleks immunologiczny. Co to znaczy? Na powierzchni każdej komórki z dowolnego organizmu istnieją specjalne struktury zwane antygeny. Antygeny w ogóle - to cząsteczki, które przenoszą informacje o komórce (jak informacje na temat odznak u ludzi, która określa podstawowe dane o osobie).

Indywidualne i specyficzne antygeny - co to jest? Dlaczego potrzebne są te antygeny?

są poszczególne antygeny, który jest przypisany do tego szczególnego organizmu. Te poszczególne antygeny są różni się od wszystkich ludzi, nie jest podobna do siebie, ale jeszcze inna. Dwa identyczne kopie poszczególnych antygenów nie istnieją!

Drugim głównym typem antygenu - jest antygeny gatunki, że tkwi w żadnych konkretnych gatunków istot żywych. Na przykład, osoba występuje specyficzny antygen, który jest wspólny dla wszystkich ludzi, u myszy jest mysim gatunek antygen, itp Na powierzchnię każdej komórki są koniecznie przedstawić gatunek i indywidualny antygen.

Specyficzny antygen stosowany komórek układu immunologicznego do rozpoznawania. „- kogoś innego”

Jak jest rozpoznanie antygenu?

Komórki immunologiczne związane z podejrzanymi komórek i przenosi identyfikator znajduje się na indywidualne antygenu. Pamięć immunologiczna „napisany” komórka wygląda „jego antygenem.” Zatem, jeżeli antygen podejrzane komórki pasuje do opisu „jego antygenem”, oznacza to, że komórka z własnym ciałem, a nie poważne. Następnie komórka odpornościowa „rozwiązał” i odchodzi. A jeśli antygen nie jest taka sama jak w opisie „a”, natomiast komórka immunologiczny identyfikuje komórkę jako „obcy”, a zatem potencjalnie niebezpieczne dla całego organizmu. W tym przypadku, komórka odpornościowy nie jest „rozwiązał” i zaczyna niszczyć niebezpiecznego obiektu. Dokładność takiego rozpoznania immunologicznego jest niesamowite - 99,97%. praktycznie żadnych błędów!

Co jest przeciwciałem kompleks immunologiczny?
Co jest przeciwciałem?

Przeciwciało - specjalny cząsteczka znajduje się na powierzchni komórek układu odpornościowego. Że przeciwciało wiąże się z antygenem i podejrzanych komórek. Dalej przesyła informacje przeciwciała do komórki, w których rozpoznanie i odbiera sygnał zwrotnego obu typów „A” lub „przeciwnika”. Kiedy sygnał „A” komunikacja zakłóca przeciwciała z antygenem i uwalnia komórek.

Co to jest kompleks immunologiczny?
Gdy sygnał „obcy” sytuacja rozwija się w różny sposób. Przeciwciało nie przerywa połączenie z antygenem, i vice versa, wysyłając konkretne sygnały, powoduje się „wzmocnienie”. Oznacza to, że biologicznie Inne przeciwciała z innych części komórki zaczynają się w obszarze, gdzie jest sygnał zagrożenia, a także utworzenia połączenia pomiędzy antygenem i złapać. W końcu, antygen jest otoczona ze wszystkich stron i mocno przeciwciała privyazan.Takoy antygen + zwanych kompleks immunologiczny. Od tej chwili do dyspozycji antygenu. Ale teraz szczegóły procesu neutralizacji antygen nie jesteśmy zainteresowani.

Rodzaje przeciwciał (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Przeciwciało - strukturę białka, które mają, odpowiednio, nazwę chemiczną, który jest używany jako synonim dla ekspresji przeciwciał. Tak więc, Przeciwciała to immunoglobuliny =.

Istnieje pięć typów immunoglobulin (Ig), które wiążą się z różnymi typami antygenów z różnych miejsc ciała ludzkiego (na przykład skóry, śluzówki, krew, itp. d.). Oznacza to, że przeciwciała mają podziału pracy. Te immunoglobulin nazywane są alfabetu łacińskiego - A, M, G, D, E i oznaczono następująco - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

W diagnostyce z wykorzystaniem tylko jednego typu przeciwciała, które jest najbardziej specyficzne dla określonego drobnoustroju. Oznacza to, że wiązanie przeciwciała z antygenem zdefiniowano zawsze zdarza. Najczęściej stosowanym IgG i IgM.

Zasada ta odpowiedź immunologiczna (unikalny swoistość i dokładność rozpoznawania określonej przez obiekt biologiczny) leży u podstaw immunoenzymatyczny wytrzymałościowe analiza.V wysokiej precyzji przeciwciała rozpoznające antygeny, dokładność wszystkich metod immunologicznych jest także lepsza.

Reakcję enzymatyczną

Co reakcja - enzymu? Jaki jest powinowactwo do substratu i produktu?
Rozważmy teraz reakcji enzymatycznej metody immunoenzymatycznej.

Jaka jest reakcja enzymatyczna?

Reakcję enzymatyczną - reakcję chemiczną, w której jedna substancja jest przekształcany przez enzym do drugiego. Substancja, która działa na enzym zwany podłoże. Substancja, która jest otrzymywana przez wpływ enzymu zwanego produkt reakcji. Przy czym cechą reakcji enzymatycznej, pewna enzym działa tylko na określonym podłożu. Ta właściwość enzymu do uznania „ich” zwany substratem powinowactwo.

Tak więc, każdy enzym przenosi tylko jedną, konkretną reakcję do niego. Enzymy w świecie biologicznym wie wielką różnorodność, a także reakcje enzymatyczne. ELISA diagnostycznej wykorzystuje tylko kilka reakcji enzymatycznych, - nie więcej niż 10. Gdy ta dobrana tak, enzymatyczny, który jest produktem reakcji substancje barwiące. Dlaczego reakcja enzymatyczna produkty muszą być pomalowane? Ponieważ nie istnieje prosty sposób chemiczny do obliczenia stężenia substancji roztworu barwnika - kolorymetryczna.

Metoda kolorymetryczna - istota i zasady

kolorymetryczna wykorzystuje pomiar gęstości barwy roztworu i przez nasycenie koloru obliczone stężenie veschestva.Pri to specjalne urządzenie, - środki kolorymetru kolor gęstości roztworu. W kolorymetrii dwa możliwe natężenie barwy w zależności od stężenia substancji - jest wprost proporcjonalna zależność lub odwrotnie proporcjonalne. Wprost proporcjonalnie, im wyższe jest stężenie substancji, tym bardziej intensywne natężenie zabarwienia roztworu. Odwrotnie proporcjonalnie, im wyższe jest stężenie substancji, tym mniejsza barwa gęstości roztworu. Technicznie odbywa się w następujący sposób: wziąć kilka roztworów o znanym stężeniu substancji zmierzona gęstość tych roztworów, stężenia wykreślono gęstości koloru (wykres kalibracyjny).

Następnie mierzy się gęstość zabarwienia roztworu, którego stężenie wydaje się, a krzywa kalibracji jest wartość stężenia odpowiadającą wysokości Zmierzone gęstości koloru rastvora.V nowoczesnych automatycznych kolorymetrów po czym wykonywana jest kalibracja, to samo urządzenie tworzy krzywą wzorcową, która pozostaje w pamięci, a następnie pomiar automatycznie.

peroksydazy: Test immunologiczny jest często stosowane następujące enzymy fosfatazy alkalicznej, awidyna.

Ponieważ łączny immunologicznego i reakcji enzymatycznej ELISA? Przejdziemy teraz do rozważenia rzeczywistego immunoenzymatyczną. Jakie są etapy to zawiera i co się dzieje, gdy te reakcje? Test immunoenzymatyczny jest bezpośrednie i pośrednie.

Bezpośredni test immunosorpcyjny - etapy

W bezpośrednim ELISA stosując przeciwciała do identyfikacji antygenu w połączeniu ze specyficznym znacznikiem. Ten szczególny etykieta jest substrat reakcji enzymatycznej.

Mocowanie antygenu powierzchniowego antygenu i związek o studzienkach z przeciwciałem

W jaki sposób bezpośredni immunoenzymatyczny? Wziąć materiału biologicznego (krwi, zeskrobin śluzu wymazów) i umieszcza się w specjalnych zagłębień. Materiał biologiczny pozostaje w studzienkach w ciągu 15-30 minut do antygenów może przykleić się do powierzchni zagłębień. Ponadto, w tych studzienek dodano przeciwciało do wykrywania antygenu. Oznacza to, że identyfikujące antygeny, takie jak syfilis, dodano przeciwciała przeciwko antygenom syfilis. Przeciwciała te są wytwarzane metodami przemysłowymi, a laboratorium kupić gotową mieszankę nabory.Dannuyu materiału i przeciwciała pozostawić na pewien czas (od 30 minut do 4-5 godzin), aby przeciwciała były w stanie znaleźć i skontaktować się z „ich” antigenom.Chem bardziej biologiczny antygeny próbki, lepszy kontakt z nimi przeciwciał.

Usuwanie niepotrzebnych „przeciwciała”

Jak wspomniano powyżej, przeciwciała są także związane ze swoistymi przeciwciałami metkoy.Poskolku dodaje się w nadmiarze, nie wszystkie z nich będą w kontakt z antygenem, a jeżeli nie ma antygenu w próbce, a zatem, żadne przeciwciało nie styka się z pożądanym antygenem. Aby usunąć „ekstra” przeciwciała, zawartość dołków tylko wylana. W rezultacie, wszystkie „nadmiar” przeciwciała są usuwane i te związane z antygenem w charakterze antygenów „przyklejone” do powierzchni zagłębień. Studzienki płukano kilkakrotnie specjalnym roztworze, który pozwala, aby umyć wszystkie „dodatkowe” przeciwciała.

Reakcję enzymatyczną - wytwarzanie związku o kolorze

Następnie rozpoczyna się drugi etap - reakcję enzymatyczną. Przemyte studzienki dodaje się do roztworu enzymu, po czym pozostawiono do odstania w ciągu 30-60 minut. Enzym ten wykazuje powinowactwo do substancji (ciężar tag), które wiąże się z przeciwciałem. Reakcje enzymatyczne prowadzono w wyniku których to zwłaszcza etykieta (substrat) przekształca się w kolorowej substancji (produktów). Następnie metoda kolorymetryczna to, że stężenia substancji barwnej. Ponieważ ten konkretny znacznik jest związany z przeciwciałem, a następnie stężenie barwnego produktu reakcji wynosi od stężenia przeciwciała. Stężenie przeciwciał równym stężeniu antygenu. Tak więc, w wyniku analizy, możemy uzyskać odpowiedź, jakie jest stężenie wykrytego mikrobiologicznych lub hormonu.

To właśnie przechodzi test immunoenzymatyczny prostą. Dziś jednak bardziej prawdopodobne, aby korzystać pośredni test immunoenzymatyczny, od czułości i dokładności pośredni wyższa niż bezpośrednie. Tak, niech pośredni immunoenzymatyczną.

Pośredni immunoenzymatyczny - etapy

W pośrednich ELISA dwóch etapach. W pierwszym etapie stosuje się niewyznakowanego przeciwciała z wykrywalną antygenów, a w drugim etapie stosuje się do pierwszych przeciwciał znakowanych przeciwciał nieznakowanego. Że nie uzyskuje się bezpośrednie wiązanie przeciwciała z antygenem i podwójną kontrolę: wiązanie przeciwciała z antygenem, przy czym wiązanie do kompleksu przeciwciało drugim przeciwciałem + antygenu. Zazwyczaj, przeciwciała w pierwszym etapie - myszy, a drugiej - kozy.

Utrwalanie antygenów na powierzchni studzienki i wiązanie antygenu z nieznakowanym przeciwciałem
Podobnie jak dla bezpośredniego immunoenzymatyczną wykonano ogrodzenie materiału biologicznego - wyskrobin krwi, wymazy. Badany materiał biologiczny dodano do studzienek i pozostawiono na 15-30 minut do wiązania się z antygenami powierzchniowymi studzienek. Następnie studzienki przyczyniają nieznakowane przeciwciała do antygenu i pozostawiono do czasu (1-5 godziny) na przeciwciało kontaktuje się z „swoje” antygenów utworzonego kompleksu immunologicznego (pierwszy etap). Następnie usunąć „nadmiar” niezwiązanego przeciwciała wylewanie zawartości studzienek. Płukania w specjalnym roztworze do całkowitego usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Wiązania znakowanego przeciwciała z antygenem, przeciwciała + niewyznakowany
Następnie drugie przeciwciało - oznaczenie, dodano do studzienek i ponownie pozostawia się na pewien czas - 15-30 minut (druga noga). W tym czasie, wyznakowane wiąże się z pierwszym - nie oznaczone i tworzą kompleks - przeciwciało + + antygenu przeciwciała. Jednakże, oznakowane i znakowane przeciwciało wprowadza się do dołków w nadmiarze. Dlatego konieczne jest, po raz kolejny, aby usunąć „ekstra”, już znakowanych przeciwciał, które nie wiążą się z nieoznakowanego przeciwciała. Procedurę tę powtarza się do wylewania zawartości studzienek i przemyciu specjalnym roztworze.

Reakcję enzymatyczną - wytwarzanie związku o kolorze
Następnie wprowadzić enzym wykonywania konwersja reakcji „znaczniki” w kolorowej substancji. Zabarwienie w ciągu 5-30 minut. Następnie przeprowadza się kolorymetrii i obliczenia stężenia kolorowej substancji. Ponieważ stężenie kolorowej substancji jest stężenie przeciwciała znakowane i stężenie znacznika jest równa koncentracji niewyznakowanego przeciwciała, która z kolei jest równa stężeniu antygenu. Tak więc, określenia stężenia antygenu wykrywalne.
Takie podwójne sterowanie za pomocą dwóch rodzajów przeciwciał zwiększyło czułość i specyficzność testu immunoenzymatycznego. Mimo wydłużenia czasu analizy oraz włączenie dodatkowych etapów, straty te są kompensowane wynik precyzja. Dlatego w chwili obecnej zdecydowana większość enzymów technik immunologicznych - jest to pośredni test immunologiczny enzymatyczny.

Jakie choroby są wykrywane przez enzym diagnostyki immunologicznych?

Rozważmy teraz, jaki rodzaj choroby i wszelkie substancje biologicznie aktywne wykryte przez enzym immunologicznym. Substancje wykryte immunoenzymatycznym są przedstawione w tabeli.


Poniższa tabela nie jest kompletna lista testów (tylko najbardziej popularne), przeprowadzone metodą ELISA. Przynieście całą listę nie jest możliwe, ponieważ będzie to bardzo duża i stale aktualizowany. W uzupełnieniu do diagnostyki laboratoryjnej przez immunoenzymatyczną jest on powszechnie stosowany w badaniach naukowych.




Autor: AK Nasedkina