PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Jak jest diagnoza PCR, wskazania, w jaki sposób przygotować się do badania, wyniki PCR

Dla właściwego i skutecznego leczenia wielu chorób zakaźnych muszą być aktualne w celu ustalenia dokładnej diagnozy. W rozwiązaniu tego problemu dzisiaj zaangażowany metod diagnostycznych high-tech na podstawie metod biologii molekularnej. W tej chwili, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest już szeroko stosowany w praktyce medycznej jako najbardziej niezawodne narzędzie do diagnostyki laboratoryjnej.

Co stanowi o popularności PCR w tej chwili?

Po pierwsze, sposób ten jest stosowany do wykrywania patogenów w wielu chorobach zakaźnych z dużą dokładnością.

Po drugie, w celu monitorowania skuteczności leczenia.

W różnych podręczników, broszur, artykułów, informacji i objaśnień specjalistów medycznych, często mamy do czynienia z wykorzystaniem niejasnych pojęć i słów. Rzeczywiście trudno jest mówić o high-tech produkty Science pospolitych słów.

Co jest istotą i mechanika PCR diagnostyczny?

Każdy żywy organizm ma swoje unikalne geny. Geny są umieszczone w cząsteczce DNA, która w rzeczywistości jest „Karta” każdego konkretnego organizmu. DNA (materiał genetyczny) - bardzo długie cząsteczki, która składa się z „cegły” o nazwie nukleotydów. Każdy wzbudnik leżą ściśle określonych chorób zakaźnych, to jest w pewnej sekwencji i kombinacji. Gdy jest to konieczne, aby zrozumieć, czy dana osoba ma dany patogen wspina materiału biologicznego (krwi, moczu, śliny, wacik), która zawiera drobnoustroje DNA lub fragmentów DNA. Jednak ilość materiału genetycznego patogenu jest bardzo mała, a to jest niemożliwe, aby powiedzieć, co dokładnie mikroorganizm jest właścicielem. Aby rozwiązać ten problem i służy jako PCR. Istotą łańcuchową reakcję polimerazy to, że niewielka ilość materiału brane do badań, zawierający DNA, a proces PCR jest zwiększenie ilości materiału genetycznego, należącej do określonego czynnika chorobotwórczego, a tym samym może być zidentyfikowany.

diagnostyka PCR - badanie genetyczne z biomateriału.

Pomysł PCR należy do amerykańskiej K.Mullins naukowiec, który zaproponował w 1983 roku. Jednak powszechne zastosowanie kliniczne otrzymał tylko w środkowej 90. XXveka.

Będziemy rozumieć terminologii IT - DNA, etc. Każda komórka każdej istoty żywej (zwierząt, roślin, ludzi, bakterie, wirusy) ma chromosom. Chromosomy - opiekunowie to informacja genetyczna, które zawierają całą sekwencję genów poszczególnych żywej istoty.

Każdy chromosom składa się z dwóch nici DNA, skręcony spiralnie względem siebie. DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy chemicznie, która składa się z elementów konstrukcyjnych - nukleotydów. 5 jest gatunkiem nukleotydowe - tymina (T), adenozyny (A), guanina (G), cytozyna (C) i uracyl (U). Nukleotydy są umieszczone jeden za drugim w ścisłej kolejności poszczególnych genów formowania. Jeden gen może zawierać 20-200 nukleotydów takie. Na przykład, gen kodujący wytwarzania insuliny składa się z 60 bp.

Nukleotydy są własnością komplementarności. Oznacza to, że w przeciwieństwie do adeniny (A) w jednej nici DNA jest wymagana tymina (T) w drugim łańcuchu, naprzeciwko guanina (G) - cytozyna (C). Schematycznie w następujący sposób:
D - D
T -
A - T
Ten klucz własnością komplementarności do PCR.

Oprócz DNA, sama struktura jest to RNA - kwas rybonukleinowy, który różni się od DNA z tym, że zamiast tyminy, uracylu jest tutaj stosowane. RNA - informacja genetyczna jest kustosz niektórych wirusów o nazwie retrowirusy (takie jak HIV).

       Cząsteczki DNA i RNA może być „pomnożyć” (ta właściwość jest używana do PCR). Następuje to w sposób następujący: dwie nici DNA lub RNA, odbiegają od siebie strony, każda nić staje się specjalny enzym, który syntetyzuje nowy łańcuch. Synteza jest zasadą komplementarności, czyli jakby w oryginalnym łańcucha DNA o wartości nukleotydu A, po czym nowo zsyntetyzowany będzie T jeśli T - to C, etc. Ten szczególny enzym „builder” wymagający „ziarna” na początku syntezy, - sekwencję nukleotydów 5-15. Ten „ziarno” określony dla każdego genu (gen Chlamydia, Mycoplasma, wirusy) doświadczalnie.

W ten sposób w każdym cyklu PCR składa się z trzech etapów. Pierwszy etap zachodzi tzw odwijania DNA - to jest połączone oddzielenia dwóch nici DNA. W drugim - jest „ziarno” Połączenie miejscu nici DNA. Wreszcie rozszerzenie pasma danych DNA, który jest wykonany fermentom- „Builder”. Obecnie w tym złożony proces odbywa się w jednej probówce i składa się z powtarzających się cyklach reprodukcji określonego DNA w celu wytworzenia dużej liczby egzemplarzy, które mogą być następnie wykryte za pomocą konwencjonalnych metod. Jest to jedna z nici DNA otrzymujemy setki lub tysiące.

Etapy badań PCR

Pobieranie próbek materiału biologicznego do badań

Jako próbkę innego materiału biologicznego, krew i jej składniki, mocz, ślina, wydzieliny błony śluzowej, płyn mózgowo-rdzeniowy, wydzieliny z rany powierzchni, zawartość jamy ciała. Wszystkie testy biologiczne zebrano narzędzi jednorazowych, a wybrany materiał zamknięty w sterylnej probówce z tworzywa sztucznego i umieszcza się na pożywce, z następnym transportu do laboratorium.

Odzyskanego próbki dodano niezbędne reagenty i umieścić w programowalnego termostatu - termocyklera (termocyklerze). Termocykler PCR powtórzono 30-50 razy w cyklu składającym się z trzech faz (denaturacji, przyłączania i wydłużania). Co to oznacza? Rozważmy szczegóły.

Etapy reakcji PCR, nadużywają kopiowaniu materiału genetycznego

ja etap PCR - Przygotowanie do kopiowania materiału genetycznego.
Prowadzi się w temperaturze 95 ° C, nici DNA są rozdzielane i mogą siedzieć „starter”.

„Startery” są wytwarzane metodami przemysłowymi różne stowarzyszenia naukowe i przemysłowe, laboratoria kupować gotowe. „Ziarno” w celu identyfikacji, takie jak chlamydia, działa tylko na chlamydia, itd. Tak więc, jeśli biomateriał jest testowana na obecność zakażenia chlamydiami, po czym mieszaninę reakcyjną umieszcza się „ziarno” dla hlamidiy- Jeżeli testowanie biomateriału z wirusa Epsteina-Barr i „ziarno” dla wirusa Epsteina-Barr.

II etap - Związek z materiału genetycznego czynnika zakaźnego i „ziarno”.
Jeśli nie jest określona przez DNA wirusa lub bakterii, „ziarno” znajduje się na DNA. Proces łączenia „ziarna”, to drugi etap reakcji PCR. Etap ten prowadzi się w temperaturze 75 ° C

III etap - kopii materiału genetycznego czynnika zakaźnego.
Ten proces faktycznie wydłużenie lub wnikanie materiału genetycznego, które występuje w temperaturze 72 ° C Przez określenie „ziarno” jest odpowiedni enzym „builder” i syntezą nowej nici DNA. Przy końcu syntezy nowych końcach łańcucha DNA oraz cyklu PCR. Oznacza to, że jeden numer cyklu PCR zwiększona dwukrotnie materiał genetyczny. Na przykład, w wyjściowej próbce miał 100 cząsteczek DNA z jakiegokolwiek wirusa, po pierwszym cyklu PCR w próbce będzie DNA, cząsteczki wirusa do 200 testów. Cykl trwa przez 2-3 minuty.

W celu utworzenia wystarczającej ilości materiału genetycznego do określania, na ogół 30-50 cykli PCR wykonywano, co trwa 2-3 godzin.

Poziom Identyfikacja propagowane materiału genetycznego

Faktycznie kończy się tutaj PCR i dalej jest nie mniej istotny etap identyfikacji. Do identyfikacji przy użyciu metody elektroforezy lub oznaczony jako „starter”. Gdy otrzymuje się z zastosowaniem elektroforezy w nici DNA są rozdzielane ze względu na rozmiar, a obecność fragmentów DNA o różnej długości wskazujący dodatni wynik analizy (to znaczy obecności wirusów, bakterie itp.) W przypadku korzystania z etykietą „ziarno” dodaje chromogenu (barwnik) do końcowego produktu reakcji, przy czym reakcję enzymatyczną towarzyszy powstawanie barwy. Rozwój kolor jest bezpośrednich dowodów, że wirus lub inny środek wykrywalne są obecne w oryginalnej próbce.

Do tej pory za pomocą oznaczonego jako „starter”, jak również odpowiednie oprogramowanie, możliwe jest, aby produkować na raz i „czytać” wyniki PCR. To tak nazyvaemayareal-time PCR.

Dlaczego diagnostykę PCR ma tę wartość?

Jedną z istotnych zalet metodą PCR jest duża czułość - od 95 do 100%. Jednak korzyści te powinny opierać się na zawsze z zachowaniem następujących warunków:

1. poprawne pobieranie próbek, transportowanie materiału biologicznego;
2. dostępność sterylnych, jednorazowych przyrządów specjalistycznych laboratoriów i wyszkolonego personelu;
3. ścisłe przyleganie do sterylnych technik i przez analizę

Czułość jest różna dla różnych bakterii wykryte. Na przykład, czułość metody PCR do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu C jest 97-98%, czułość wykrywania Ureaplasma - 99-100%.

Możliwości związane w analizie PCR, może osiągnąć niezrównaną swoistość analityczną. Oznacza to, że identyfikacja mikroorganizmu jest to, że szuka, nie są podobne lub ściśle powiązane.
Czułość i swoistość diagnostyczną metody PCR, często przewyższają dla metody hodowli, zwany „złoty standard” do wykrywania chorób zakaźnych. Biorąc pod uwagę czas trwania rosnącej kultury (od kilku dni do kilku tygodni), zaletą PCR jest oczywiste.

PCR w diagnostyce zakażeń
Zalety metody PCR (czułości i swoistości) określa szeroki zakres zastosowań w nowoczesnej medycynie.
Główne zastosowania diagnostyki PCR:

1. Rozpoznanie ostrych i przewlekłych chorób zakaźnych różnych lokalizacji
2. monitorowanie skuteczności terapii
3. wyjaśnienia rodzaju patogenu

PCR stosowane w położnictwie i ginekologii, neonatologii i pediatrii, urologii, Wenerologii nefrologii, zakaźne choroby klinicznej, okulistyce, neurologii Phthisiopneumology et al.

Wykorzystujące PCR Diagnostics przeprowadza się w połączeniu z innymi metodami badawczymi (ELISA, MTP fif i in.). Ich połączenie i określa zasadność lekarza prowadzącego.

czynniki zakaźne wykryte metodą PCR

wirusy:

1. Retrowirusy HIV-1 i HIV-2
2. wirusy opryszczkowe
3. typy wirusa Herpes simplex 1 i 2
4. wirus cytomegalii
5. Wirus Epsteina-Barr
6. Varicella - zoster virus
7. ludzkie wirusy opryszczki 6 i 7
8. wirusa zapalenia wątroby typu C, B i A
9. wirusy brodawczaka ludzkiego
10. wirus różyczki
11. adenowirusy
12. rinowirusy
13. parwowirus
14. pikornovirusy

bakterie:

1. prątki
2. chlamydia
3. Mycoplasma
4. salmonella
5. Legionella
6. Clostridium
7. blado Treponema
8. Różne rodzaje chorobotwórczych E. coli
9. Vibrio cholerae
10. Rickettsia
11. aurococcus
12.  czynnikiem sprawczym bakteryjnego zapalenia opon mózgowych
13. Helicobacter pylori
14. Ureaplasma
15. rzeżączka
16. błonica Bacillus
17. Haemophilus influenzae

Na tej liście są najczęstsze czynniki zakaźne wykrywane przez PCR. W rzeczywistości, ta lista jest znacznie szerszy, stale aktualizowana, a zsyntetyzowany nowy „ziarno”. Również należy zauważyć, że lista zidentyfikowanych patogenów zależy od obecności „nasiona” dla identyfikacji w arsenale każdego laboratorium.


Autor: AK Nasedkina